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臨床検査技師

実験記録（備忘録）

目次
  1. 試薬・資材の保存
  2. 廃棄ルール
  3. ミニプレップとミディプレップの違い
  4. カットチェック⇨大腸菌へインジェクト⇨シャーレ培養(18~24h)
    1. プラスミドの制限酵素チェック（カットチェック）とは
    2. カットチェックの方法
  5. ミニプレップ
    1. シャーレ培養⇨LB培地5mLでOverNight
    2. プラスミド抽出：QIAquick PCR　Purification Kit（QIAGEN)
  6. ミディプレップ：Xtro Midi
    1. シャーレ培養⇨フラスコ培養
    2. プラスミドDNAの抽出
  7. 細胞培養
    1. 培養室のルール
    2. 凍結融解
  8. 試薬作成
    1. 融合蛋白の合成
  9. 辞典
    1. EF-1a promoter
    2. Kozak配列
    3. サイレンシング
    4. トランスフェクション

試薬・資材の保存

試薬 保存場所 調整後の保存期間
AMP（50mg/mL） 入口入って左側の冷凍庫に小分け分注
LB培地（粉） 薬品庫
LB培地（液） 冷蔵庫
EXL10-Gold（大腸菌） 入口入って右側の冷凍庫に小分け分注(100or200ul)
チューブ用○シール 机右端上段引き出し
Xtra Midi 机左端下段引き出し
黄色蓋滅菌チューブ 左から３番目の引き出し上段
Mini prep クリーンベンチ向いの机上
消えないマジック 机右端上段引き出し
イソプロパノール 試薬庫
エタノール 試薬庫

廃棄ルール

廃棄物 廃棄方法 備考
爪楊枝（コロニー用） 滅菌ゴミ クリーンベンチ内
集菌後上清LB培地 滅菌後回収用タンクへ
AMP分注チップ 普通ゴミ
プラスミド 普通ゴミ

ミニプレップとミディプレップの違い

ミニプレップ ミディプレップ
目的 確認プラスミド用 確定プラスミド用
採取プラスミド量 少ない 多い
培養液作成
  1. 導入済大腸菌（１コロニー）を5mLのAMP入LB培地へ
  1. 導入済大腸菌（１コロニー）を2mLのAMP入LB培地へ
  2. 半日培養して濁りが確認できればLB培地（フラスコ、90mLor180mL）へ1/500量〜全量添加する
AMP 50mg/mLをFinal100ug/mLになるようにLB培地に添加する
  1. 2mLのLB培地には4uL
  2. 90or180mLは1/500量
一度に実施できる本数 4 4

カットチェック⇨大腸菌へインジェクト⇨シャーレ培養(18~24h)

プラスミドの制限酵素チェック（カットチェック）とは

ライゲーションに問題がないことを確認する。

ライゲーションは、酵素の作用による 2 つの核酸断片の結合です。これは、 DNAの分子クローニングにおいて不可欠な実験手順であり、 DNA 断片を結合して組換え DNA分子を作成します (外来 DNA 断片をプラスミドに挿入する場合など)。DNA 断片の末端は、1 つの DNA 末端の 3′-ヒドロキシルと別の 5′-ホスホリルとの間のホスホジエステル結合の形成によって結合されます。RNAも同様にライゲーションすることができる。一般に補因子が反応に関与しており、これは通常ATPまたはNAD +です。. 真核細胞のリガーゼは ATP タイプに属し、NAD+ 依存性は細菌 (大腸菌など) に見られます。

 

前の実験で調製したプラスミド DNA を制限酵素で切って電気泳動してみます。
正しい形に組み立てられているプラスミドならどう切れるか（？）、セルフライゲーション
していたらどう切れるか（？）、など、考えられるいくつかのパターンを想定し、
電気泳動したときにそれらのバンドのパターンから自分の拾ったコロニーが
”本物の”プラスミドを持っているのかどうかを、ある程度知ることができます。

当施設では、単独コロニーを取ってきて複数培養して、他とバンドが異なるものを”ハズレ”としてやり直す、当たりのものを次ステップに進める。

カットチェックの方法

準備

  1. プラスミドDNAをQbitで測定する場合はFinal0.2ug/uLになるようにMilliQで希釈する。
  2. Qbitで測定しない場合は37℃培養なら0.5uL、32℃培養なら1uL添加する。
  3. 下記内訳で合計10uLになるように調整する
希釈DNA 0.5uL / 1uL
x10Buffer 1uL
制限酵素（１種類につき） 0.2uL
残 MilliQ
合計 10uL
  1. 37℃で1~24時間インキュベートする

アガロースゲル電気泳動

  1. アガロース１％＋1xTAEで泳動用ゲルを作成する（穴13箇所）
  2. 電気泳動器具に1xTAEを注ぎ①で作成したゲルを沈める
  3. 前日に調整したプラスミドDNAに6xローティングバッファーを2.5uLずつ添加
  4. ゲルの先頭にサイズマーカー（Thermo Scientific GeneRuler 1Kb）6uL添加
  5. 各穴に③を全量添加
  6. 135V・20分で電気泳動開始　※ゲルをはみ出る心配はなし

泳動パターンの確認

  1. 泳動後のゲルをBluPADへ乗せる
  2. 上から専用のカバーを設置して部屋の電気を消す
  3. 覗き穴からバンドを確認して当たり・ハズレをチェックする
  4. 当たりをピックアップして机右上の○シールにNoを書いてチューブに貼る

ライゲーション：プラスミドの大腸菌への導入

  1. ブロックインキュベーターを4℃にセット
  2. MilliQ99.5uL+当たりプラスミド0.5uLで200倍希釈する
  3. ボルテックス＋スピンダウン
  4. 新しいチューブに大腸菌（XL10-Gold)を20〜30uL添加する
  5. ③に②を0.5uL添加する
  6. 4℃のブロックインキュベーターで30分間インキュベーション

プラスミド導入後の大腸菌の培養時間は培養温度で下記の通り異なる。

  • 37℃：16時間
  • 32℃：24時間

37℃で増殖が悪い場合に32℃で培養する。この理由は、37℃だとプラスミドの発現量が多く、大腸菌の増殖を粗大している可能性を考える。32℃だとプラスミドの発現量が低下するため大腸菌が増殖できる、と推測

  1. 42℃45秒でヒートショックを与える※タイマーで計測する
  2. ４℃で2分〜

培地にまく

  1. LB培地（シャーレ）にSample名を記載する
  2. プラスミド導入済大腸菌チューブを軽くスピンダウンする
  3. アルコールに浸ったスプレッター（とんぼ）に火をつけて火炎消毒する
  4. 逆さまにしてラックに立てて冷ます
  5. ②をピペットでシャーレに雑にまく※シングルコロニーが欲しいため
  6. 培地にラップを巻いてインキュベーターへ

ミニプレップ

シャーレ培養⇨LB培地5mLでOverNight

  1. LB培地（液体）を培養チューブに5mL分注する
  2. ①にAMPをFinal100ug/mLになるように添加する（10uL）
  3. 爪楊枝でシングルコロニーを採取して懸濁
  4. 孵卵器で培養（37℃半日or32℃1日,200rpm※フラスコがある場合は180rpmで）

プラスミド抽出：QIAquick PCR　Purification Kit（QIAGEN)

  1. 5mLの培養液を2段階目までキャップを閉めて5000rpm,5min遠心する
  2. 1.5mlチューブを1Sampleにつき2本準備する※フタにNoを記載しておく
  3. 懸濁用バッファー（P1)を冷蔵庫から取り出す
  4. ①をデカントして10秒程度遠心、ピペットマンで残液を除去する
  5. P1：250uLでペレットを懸濁してしっかりボルテックス※空チューブは滅菌ゴミ
  6. P2：250uLを分注して転倒混和※ボルテックスはNG、青くなったりならなかったりする
  7. M3：350uL分注して転倒混和
  8. 室温、13000rpm、10分間遠心※ホルダーを1.5ccチューブ用に付け替える
  9. 遠心中にカラムを準備してNoを記載する
  10. デカントでカラムに移す、残液はピペットマンで移す
  11. 室温、13000rpm、30秒〜60秒間遠心
  12. チューブに落下した液をデカントで捨てる
  13. PB：500uL分注して室温、13000rpm、30秒〜60秒間遠心
  14. チューブに落下した液をデカントで捨てる
  15. PE：750uL分注して室温、13000rpm、30秒〜60秒間遠心
  16. チューブに落下した液をデカントで捨てる
  17. 空で13000rpm、60秒間遠心
  18. チューブを新しいものに入れ替える
  19. MilliQ：50ul分注して1分間静置
  20. 13000rpm、30秒〜60秒間遠心
  21. カットチェックへ

ミディプレップ：Xtro Midi

シャーレ培養⇨フラスコ培養

  1. LB培地（液体）を培養チューブに2mL分注する
  2. ①にAMPをFinal100ug/mLになるように添加する（4uL）
  3. 爪楊枝でシングルコロニーを採取して懸濁
  4. 孵卵器で培養（37℃or32℃,200rpm※フラスコがある場合は180rpmで）
  5. 半日培養して懸濁を確認できたらフラスコに培地の1/500量〜全量添加する
  6. 37℃または32℃でOverNight

プラスミドDNAの抽出

  1. 遠心機を４℃6,000 rpmでセットして空運転させておく
  2. 培養液を50mLチューブに均等に分注する
  3. 4℃, 6,000 rpmで10分間遠心をして、大腸菌をデカントで50 mlチューブに集菌する。※チューブのメモリを外側に統一する、終了したら22℃8,000rpm,10minで空運転する
  4. 4℃, 6,000 rpmで10秒遠心をして、大腸菌を50 mlチューブにピペットマンで集菌する。
  5. 8 mlのBuffer RES（冷蔵庫）を各チューブに等分ずつ加えて（4本なら2mLずつ）ボルテックスでペレットが剥がれるまでMixする
  6. ピぺッティングでペレットをほぐしながら１つのチューブにまとめてボルテックする※空チューブは滅菌ゴミ
  7. 8 mlのBuffer LYS（青い試薬）を加えて5回程度上下反転させ、室温で5分間インキュベートする
  8. 8 mlのBuffer NEUを加えて液が透明になるまで5回程度上下反転させ、室温で5分間インキュベートする
  9. 待ち時間でカラムを準備する。文字を上向きにしてNoを記載する。Oリングをつけて新しい50mLチューブにセットする。
  10. カラムのふちにピペットの先を付けて、カラム全体にBuffer EQU 12 mlを浸透させる。自然落下により落ちるのを待つ。
  11. 室温8,000 rpmで10分間遠心し、上清をカラムに移す。自然落下により落ちるのを待つ
  12. ここで一度廃液を捨ててチューブを空にする
  13. 5 mlのBuffer EQUを⑨と同様にカラムに浸透させ、自然落下により落ちるのを待つ（カラム洗浄1回目）
  14. カラムからフィルターを除去する※入っていた容器にもどす
  15. 8 mlのBuffer WASHを加えて、自然落下により落ちるのを待つ（カラム洗浄2回目）。
  16. 全ての液が落下したら新しい50mLチューブに移す
  17. 5 mlのBuffer ELUを加えて、自然落下により落ちるのを待つ。溶出液を50 mlチューブに回収する
  18. 溶液内のDNA濃度をQbitで測定する※希釈はMilliQを使用する

プラスミドDNAの精製（以降はクリーンベンチ内で作業）

  1. 遠心機を4℃, 10,000 rpmで30分間にセットして空運転させる
  2. 溶出液に3.5 mlのイソプロパノール（室温）を添加して、DNAを沈殿させた後、4℃, 10,000 rpmで30分間遠心する。＊上清を注意深く捨てる。ペレットが剥がれやすいので要注意。終了したら室温, 10,000 rpmで10分間にセットして空運転
  3. 待ち時間で70％エタノールを作成する※必要量＋1mL作成でOK。70％エタノールは用事調整
  4. 4℃, 10,000 rpmで5秒間遠心して上清をピペットマンで捨てる。
  5. DNAペレットを2 mlの70%エタノール（室温）で洗浄し、室温, 10,000 rpmで10分間遠心する。上清を注意深く捨てる。＊ペレットが剝がれやすいので要注意！
  6. チューブの蓋を開けた状態でDNAペレットを5〜10分間空気乾燥させて、適切な量のMilliQに溶解する。
適切な量とは

Qbitで測定したDNA量をガイドにしてFinal2ug/mLになる量を添加する。

Qbit 希釈倍率 ELU量 合計 MilliQ
7.42 10 5 371ug 185uL
  1. ペレットが底になるようにチューブを寝かせてMilliQを添加し、適当な時間浸しておく
  2. 黄色蓋の滅菌チューブに消えないマジックでNoをふる
  3. ⑤を慎重にピぺッティングして均一になったら⑥に移す※ペレットは多少管壁に残る

細胞培養

細胞株 スピカ K1株 S株
培地 Spica-M100 BalanCD CHO GROWCHO GROW TH A Dynamis Med
L-Glutamin 不要 1％添加 1％添加
Anti-Clumping Agent 1％添加 1％添加 1％添加

培養室のルール

  • 開封試薬は冷蔵庫上段、未開封試薬は下段に格納する
  • 安全キャビネット内に物を入れる際はアルコール消毒する
  • チューブ類開封前はキャップ周辺をバーナーで炙る
  • ゴミは外に廃棄する
  • 開封したらクリップで封をする
  • アスピレーターはアスピレートピペットを刺す前後にアルコールを吸引させる
  • アスピレートピペットは長い場合は折って短くする
  • アスピレーター使用次はアスピレートピペットの先端に200ul用のチップを装着する
  • 遠心条件は1,200rpm,3分

凍結融解

詳細はCHO -Spica取扱説明書を参照すること

使用試薬・器材の準備

  • 培地
  • サプリメント
  • アスピレーター
  • ピペット
  • チップ

培地の作成

培地＋サプリメントを混合して作成

培地の加温

作成した培地を37℃で加温する

細胞融解

  • 凍結チューブを2分間程度37℃で加温する
  • 氷が少し残る程度まで溶けたら培地に添加する

試薬作成

融合蛋白の合成

GFP

GFPの遺伝子配列は、約238塩基対から構成されます。 GFPの遺伝子は、Aequorea victoriaの一種のクラゲに由来します。 GFPの遺伝子は、細胞内で蛍光タンパク質を合成するために必要な情報を承知します。 GFPの遺伝子は、その他の生物にも挿入され、研究や応用に利用されています。

GFPの遺伝子配列：出典：GenBank （NCBI)  

GFP 遺伝子配列の著作権は Clontech Laboratories, Inc. にあり、American Type Culture Collection (ATCC) によって配布されています。

RFP

RFPの中には特許を取得しているものもあり、その配列は自由に入手できない可能性があることに留意することが重要です。特定のRFPの遺伝子配列をお探しの場合は、そのタンパク質の特許を所有している企業や団体に確認されることをお勧めします。

RFPの遺伝子配列：出典：GenBank （NCBI)  

プロテインA

Staphylococcus aureus spa gene for protein A

https://www.thermofisher.com/blog/learning-at-the-bench/protein-basic14/

https://www.uniprot.org/uniprotkb/Q70AB8/entry

プロテインG

https://www.uniprot.org/uniprotkb/Q54181/entry

プロテインL

https://www.uniprot.org/uniprotkb/P02989/entry

プロテインG/A

Pierce™ リコンビナント プロテイン A/G

辞典

EF-1a promoter

EF-1a promoterは、細胞内タンパク質合成に関与する遺伝子の啟動に用いられるプロモーターです。EF-1aは、細胞内の様々な細胞周期段階で発現し、細胞の増殖や分化に関わっています。このため、EF-1aプロモーターは、細胞培養や細胞研究において非常に有用であり、多くの研究において使用されています。

EF-1aプロモーターは、細胞内タンパク質合成に関与する遺伝子の啟動に用いられます。EF-1aは、細胞の複製や分化に関わる遺伝子を発現するために必要なタンパク質であり、EF-1aプロモーターはその発現を制御します。

EF-1aプロモーターを使用することで、研究者は特定の細胞や細胞状態で特定の遺伝子を発現させることができます。例えば、細胞の増殖や分化に関連する遺伝子を発現させるためにEF-1aプロモーターを使用することができます。また、EF-1aプロモーターを使用して、細胞内の様々な細胞周期段階での特定の遺伝子の発現を調べることもできます。

EF-1aプロモーターは、遺伝子組み換え技術を用いて、特定の細胞や細胞状態で特定の遺伝子を発現させることができるため、細胞培養や細胞研究において非常に有用であり、多くの研究において使用されています。

Kozak配列

Kozak配列は、遺伝子翻訳開始点の近くに存在するDNA配列のことです。Kozak配列は、翻訳開始点において、核酸配列が特定の構造を持っていることが知られています。この特定の構造は、翻訳開始点におけるタンパク質合成の開始を促進し、遺伝子の発現を増加させることができます。

Kozak配列は、「A/GCCACC」という配列が最も有効であることが知られており、この配列は、翻訳開始点において、良好な翻訳開始点として機能します。この配列に似たものも多く見られ、研究者はこれを用いて遺伝子組み換えを行うことができます。

Kozak配列は、遺伝子組み換え技術を用いた細胞研究や遺伝子治療などにおいて重要な役割を担うことが期待されており、多くの研究において使用されています。

サイレンシング

サイレンシング (gene silencing) とは、特定の遺伝子の発現を抑制することを指します。サイレンシングは、遺伝子の発現を抑制するために、いくつかの異なるメカニズムが使用されます。

RNAインターフェイス (RNA interference, RNAi) と呼ばれるメカニズムは、一般的に使用されるサイレンシングメカニズムの一つです。RNAiは、特定の遺伝子のmRNAを除去することによって遺伝子の発現を抑制するために使用されます。

クリスプ (CRISPR) と呼ばれる技術もサイレンシングのために使用されます。CRISPRは、特定の遺伝子のDNAを直接改変することによって遺伝子の発現を抑制するために使用されます。

サイレンシングは、疾患のゲノミック治療や、細胞培養における研究などにおいて重要な役割を担うことが期待されており、多くの研究において使用されています。

トランスフェクション

トランスフェクション (transfection) とは、外部からDNAやRNAを細胞に導入することを指します。トランスフェクションは、遺伝子組み換え細胞、遺伝子療法、タンパク質合成のスクリーニングなど、幅広い研究分野で使用されています。

トランスフェクションには、複数の方法があります。一般的に使用される方法には、物理的にDNAを細胞に導入する方法、化学的にDNAを細胞に導入する方法があります。

物理的にDNAを導入する方法には、電気ショック、高圧酸素、高圧酸素震盪などがあります。化学的にDNAを導入する方法には、カルボニル基を有するポリマーや、デオキシリボ核酸を用いる方法があります。

トランスフェクションは、細胞内にDNAやRNAを導入するために必要な技術であり、遺伝子療法やタンパク質合成のスクリーニングなど、幅広い研究において使用されています。